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什么是抗體片段和抗體片段化
抗體片段化，就是用工具（蛋白酶及化學(xué)物質(zhì)）將抗體分子切成特定大小的片段。Why？因?yàn)樵趯?shí)際運(yùn)用時(shí)，抗體分子真的太大了！抗體分子的分子量一般為幾百道爾頓（例如IgM五聚體就更龐大了），分子直徑在10 nm~15 nm之間，而制備成抗體片段后，就呈現(xiàn)出各自的優(yōu)勢(shì)。
抗體片段特性及功能
抗體片段化后，因去掉了某些功能結(jié)構(gòu)域以及分子量的改變，具有與全長(zhǎng)抗體不同的特性：
1、顯著降低Fc的非特異性結(jié)合；
2、沉淀和免疫印跡中可降低抗體與proteinA、proteinG的結(jié)合；
3、更好的組織滲透性，免疫組化實(shí)驗(yàn)中染色效果更優(yōu)異；
4、避免全長(zhǎng)抗體的空間位阻效應(yīng)，在固相抗原檢測(cè)中靈敏度更高；
5、在抗原-抗體結(jié)合研究中可避免Fc相關(guān)作用因子的干擾；
6、X-射線晶體學(xué)或核磁共振研究免疫識(shí)別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)時(shí)系統(tǒng)更加簡(jiǎn)化；
7、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)相對(duì)全長(zhǎng)抗體具有更低的免疫原性；
8、能偶聯(lián)或結(jié)合酶、毒素、藥物及放射性核素等。
抗體片段的這些優(yōu)勢(shì)可使其很好地應(yīng)用于免疫化學(xué)技術(shù)、臨床診斷及治療等領(lǐng)域。
IgG片段化工具
木瓜蛋白酶Papain
來源于女生喜愛的水果—番木瓜，非特異性的巰基蛋白內(nèi)切酶，分子量23 kDa，它在還原劑的存在下能將IgG切割成三個(gè)片段：2個(gè)Fab片段和1個(gè)Fc片段，zui適反應(yīng)pH6.5。木瓜蛋白酶zui初是被用于制備Fab片段，不過它也可以用來制備F(ab')2片段，但是需要將其先用半胱氨酸活化，然后*去掉半胱氨酸再和IgG共同孵育。但是得到的F(ab')2片段并不均一，而且如果有半胱氨酸存在很容易過度切割。 胃蛋白酶Pepsin 由胃粘膜主細(xì)胞（gastric chief cell）分泌，非特異性的巰基蛋白內(nèi)切酶，分子量35 kDa，它能將IgG切割成1個(gè)F(ab')2片段加Fc的多肽碎片（Fc’，可通過透析等方法除去），在中性及堿性環(huán)境下會(huì)不可逆失活，zui適反應(yīng)pH1.0。F(ab')2片段在溫和的還原劑（如2-Mercaptoethylamine•HCl，2-MEA）作用下可得到2個(gè)單價(jià)的含巰基的Fab‘片段，這些片段因?yàn)樽詭€基可以用來偶聯(lián)檢測(cè)標(biāo)記物而不影響片段的結(jié)合活性，當(dāng)然也可以用N-Ethylmaleimide (NEM)將巰基保護(hù)起來防止再次形成F(ab')2。
無花果蛋白酶
來源于無花果樹的膠乳和不成熟的果實(shí)乳汁，非特異性的巰基蛋白酶，分子量26kDa，它能在4 mM半胱氨酸的環(huán)境下將IgG切割成1個(gè)F(ab')2片段加Fc的多肽碎片（Fc’），或者在25 mM半胱氨酸的環(huán)境下將IgG切割成2個(gè)Fab片段加Fc的多肽碎片（Fc’），zui適反應(yīng)pH6.4。無花果蛋白酶水解IgG得到的F(ab')2片段大小與胃蛋白酶水解IgG得到的非常接近，而其免疫活性和親和力則與全長(zhǎng)IgG1抗體別無二致，在制備鼠類IgG1的片段時(shí)無花果蛋白酶是。
IgM片段化工具
不同種屬的IgM片段化產(chǎn)物是有差異的，如鼠和人IgM在單體的連接方式上的不同導(dǎo)致二硫鍵位置的不同使得產(chǎn)物有差異，另外不同物種IgM上寡聚糖修飾的差異也會(huì)影響酶的切割，所以不同種屬的IgM進(jìn)行片段化需要不同的條件，沒有一套通用的方案。
胃蛋白酶Pepsin：可將IgM切割成F(ab')2、Fab和Fv片段。
胰蛋白酶Trypsin：絲氨酸蛋白酶，zui適反應(yīng)pH8.0?？蓪gM切割成F(ab')2、Fab、IgG型和Fc5片段。
化學(xué)試劑：2-MEA可將IgM處理成"IgG"型片段或/和還原型IgG ("rIgG") 片段。對(duì)小鼠IgM控制還原條件可以產(chǎn)生反轉(zhuǎn)的"IgG"型片段。
