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流式細胞術(shù)實驗中的常見問題及其解決方法
本文匯總了流式細胞術(shù)實驗中常見問題（無法標(biāo)記、PE抗體檢測不到但FITC可檢測到、非特異性染色、熒光強度弱、散射光信號異常、結(jié)果與預(yù)期相反等），并給出了各種可能的原因以及對應(yīng)的解決方法，希望對您實驗有所幫助。
一、細胞無法標(biāo)記
1．確保所有的抗體都按照廠商的說明書正確存儲。
2．確保商品化抗體沒有超過有效期。
3．確保已正確加入足量的抗體。
4．確保抗體已連接熒光素。如果未連接熒光素，需加入連接有熒光素的二抗。
5．確保二抗是好的，也就是說二抗曾經(jīng)能與另外的一抗成功結(jié)合。
6．確保使用了正確的二抗，就是說二抗能夠識別你的一抗。
如果使用的是PE或APC熒光素的抗體，確保該抗體未被冰凍過。
你要檢測的組織上是否表達該抗原？可查看相關(guān)文獻了解該抗原的表達情況，或者同時做一個陽性對照。
抗體是否能識別檢測物種的抗原位點？可檢查抗體的交叉反應(yīng)列表，看看抗體是否適用于你要檢測的物種標(biāo)本。不是所有的抗體都能夠檢測所有物種相應(yīng)抗原。 7．確保使用正確的激光來激發(fā)熒光素，并使用了正確的通道來檢測該熒光。
二、PE抗體無法標(biāo)記，而FITC抗體的結(jié)果卻很好
1．PE熒光素可能冰凍過。如果冰凍過，建議另外買一管新的抗體。
2．多聚甲醛（PFA）可能會導(dǎo)致此問題。PFA降解后可釋放出甲醇，從而影響染色。所以切記PFA盡可能新鮮配制，或者細胞盡可能不要固定，染完色就立即檢測。
三、非特異性染色
1．非特異性染色可能是由于自發(fā)熒光。
解決方法：用一管只加細胞不加抗體的空白管，查看細胞自發(fā)熒光水平。
某些細胞可表達低親和力的Fc受體CD16/CD32，這種受體可通過Fc片段結(jié)合大多數(shù)抗體。對于小鼠細胞，可使用SeroBlockFcR阻斷該位點。
2．非特異性染色也可能是由于二抗引起，建議選擇一種只與一抗反應(yīng)、卻不會與檢測組織發(fā)生交叉反應(yīng)的二抗。 確保洗滌充分。
3．小心滴定抗體。降低抗體濃度可減少非特異性染色。
四、熒光強度弱
1．熒光弱可能是由于抗體過度稀釋。因此使用前通過正確滴定抗體，以確保抗體濃度適當(dāng)。
2．直標(biāo)時，熒光弱也可能是由于前帶現(xiàn)象引起（概念見表格后解釋），因此，小心正確滴定抗體很有必要。
3．熒光弱可能由于細胞數(shù)量過多。建議正確調(diào)整細胞密度，一般低于1×10E7/ml。
4．熒光弱可能是由于抗原本身就表達低，可通過查閱文獻，明確抗原表達水平。
5．如果查閱到該抗原確實本身表達弱，那么建議選擇更亮的熒光素。
6．在交叉反應(yīng)明顯的抗體中，其熒光強度弱于特異性高的單克隆抗體。
7．一抗或二抗的孵育時間和溫度均需優(yōu)化。 散射光異常
8．確保細胞是新鮮收集的，否則容易出現(xiàn)大量死細胞和碎片。
9．對細胞進行刺激、活化時，可影響細胞散射光特性。
10．如果要裂解紅細胞，確保裂解液新鮮配制并且配制正確。
五、結(jié)果與預(yù)期的相反
1．有些試劑可能會影響某些抗原檢測，例如EDTA可影響一些血小板標(biāo)記的檢測。
2．裂解液也可以影響一些抗原檢測，此時可采用PBMC提取法試試。
3．有些抗原是表達在胞內(nèi)的，故需選擇正確的破膜劑進行正確的破膜處理。
前帶現(xiàn)象：1929年Heidelberger利用等量抗體檢測濃度遞增抗原，當(dāng)抗原濃度較低，抗體濃度相對較高時，沉淀反應(yīng)不明顯；當(dāng)抗原濃度增加到與抗體濃度比例合適時，沉淀反應(yīng)明顯；繼續(xù)增加抗原濃度時，沉淀反應(yīng)反而減弱。據(jù)此繪出雙相應(yīng)答曲線，曲線高峰區(qū)域，抗體、抗原濃度呈zui適比，沉淀反應(yīng)明顯，稱等價帶。高峰區(qū)域左側(cè)，由于抗體濃度過高，沉淀反應(yīng)不明顯，稱前帶；高峰區(qū)域右側(cè)。由于抗原濃度過高，沉淀反應(yīng)也不明顯，稱后帶?？贵w濃度過高所致結(jié)果稱前帶現(xiàn)象，抗原濃度過高所致結(jié)果稱后帶現(xiàn)象，統(tǒng)稱為帶現(xiàn)象。1977年Green把此現(xiàn)象稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect)，包括了前后帶現(xiàn)象。