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聚焦 RNA，安捷倫 Cary 3500 分光光度計(jì)智啟純度評(píng)估新高度
在生物制藥領(lǐng)域，核糖核酸（RNA）的質(zhì)量控制至關(guān)重要，直接關(guān)系到基因表達(dá)研究的可靠性和藥物制造的安全性。傳統(tǒng)RNA純度評(píng)估通常依賴于 260nm 和 280nm 的吸光度比值測(cè)量。然而，這種方法存在局限性，因?yàn)镽NA樣本緩沖液的 pH 值和離子強(qiáng)度變化會(huì)影響 A260/280 比值，進(jìn)而影響純度評(píng)估的準(zhǔn)確性。
聚焦以上挑戰(zhàn)，Agilent 的研究團(tuán)隊(duì)精心設(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探討了這些因素對(duì) RNA 純度評(píng)估的影響，并據(jù)此提出了改進(jìn)方法。本研究使用 Agilent Cary 3500 Multicell Peltier UV-Vis 分光光度計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并借助 Agilent Cary UV Workstation 軟件完成數(shù)據(jù)采集。
實(shí)驗(yàn)包括三個(gè)部分：
1
研究 pH 值和 Na2HPO4 濃度對(duì) RNA 的 A260/280 比值和吸收度的影響。
2
研究 pH 值和離子強(qiáng)度對(duì) RNA 中溶解的 BSA 蛋白的 A260/280 比值的影響。
3
對(duì) HeLa RNA 在 1 mM Na2HPO4、TNE 緩沖液和水中的 UV 吸收掃描分析。
圖 1. pH 值和 Na2HPO4 的濃度在（A）A260/280 比率和 （B）吸光度上的影響。（C）260 nm 和 280 nm 處吸光度的百分比變化
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨著 RNA 樣本緩沖液 pH 值和 Na2HPO4 濃度的增加，A260/280 比值顯著上升，尤其是在 pH 值 7.2 至 8.6 和 Na2HPO4 濃度 0.02 至 1 mM 的區(qū)間內(nèi)，其增長尤為明顯。這一發(fā)現(xiàn)表明，通過精確控制緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度，可以更準(zhǔn)確地評(píng)估 RNA 的純度。
圖 2. 在蛋白質(zhì)存在或不存在的情況下，pH 值和離子強(qiáng)度對(duì) RNA A260/280 比率的影響。（A） 在 10 mM Na2HPO4 中分別加入 RNA、蛋白質(zhì)和 RNA 加標(biāo)蛋白質(zhì)的吸光度曲線（B） RNA、蛋白質(zhì)和 RNA 加標(biāo)蛋白質(zhì)分別在 0.01 至 10 mM Na2HPO4 中的 A260/280 比率圖
可觀察到，在 10 mM Na2HPO4 中加入蛋白質(zhì)前后，RNA 的 A260/280 比值從 2.15 降至 1.61，表明蛋白質(zhì)改變了 RNA 的吸收度。且在水和 1.0 mM Na2HPO4 中，RNA與蛋白質(zhì)的 A260/280 比值分別下降了 19.1% 和 26.6%，表明在堿性條件下 RNA 樣本中蛋白質(zhì)污染的檢測(cè)靈敏度顯著提高，這對(duì)于確保 RNA 樣本保持高質(zhì)量具有重要意義。
圖 3. 在水、TNE 緩沖液和 1 mM Na2HPO4 中測(cè)試 HeLa RNA 的吸光度曲線
1 mM Na2HPO4 和 TNE 緩沖液中的 RNA 吸收光譜相似，而水中的 RNA 光譜則向更高波長移動(dòng)。建議使用堿性緩沖液溶解提取的 RNA。
圖 4. Agilent Cary 3500 Multicell Peltier UV-Vis 分光光光度計(jì)硬件與軟件設(shè)置（內(nèi)置算法）
Agilent Cary 3500 Multicell Peltier UV-Vis 分光光度計(jì)在相關(guān)研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。該設(shè)備設(shè)計(jì)創(chuàng)新，包括具備八個(gè)比色皿位置，極大地提高了測(cè)量效率。其可同時(shí)測(cè)量多個(gè)樣本的能力避免了遭受實(shí)驗(yàn)變量干擾，增強(qiáng)了結(jié)果的可靠性。
此外，Cary 3500 的內(nèi)置方程軟件功能能夠自動(dòng)計(jì)算 A260/280 比值，進(jìn)一步提高了分析的吞吐量。該設(shè)備的軟件與 Agilent OpenLab 軟件套件兼容，能有效確保數(shù)據(jù)的安全獲取和存儲(chǔ)，符合 FDA 21 CFR Part 11、EU Annex 11 以及其他國家類似的法規(guī)要求。這使得 Agilent Cary 3500 分光光度計(jì)成為受監(jiān)管環(huán)境中 RNA 質(zhì)量控制的理想選擇。
通過深入探索與技術(shù)創(chuàng)新，Agilent 研究團(tuán)隊(duì)成功破局難題，為科研人員提供了更為精準(zhǔn)、高效率的 RNA 純度評(píng)估手段，確保 RNA 質(zhì)量控制全流程堅(jiān)實(shí)可靠。更多精彩詳情與生物制藥領(lǐng)域深度研究，將持續(xù)為您放送。