PriCells: 原代細(xì)胞培養(yǎng)后，碘克沙醇梯度溶液分析主要細(xì)胞器                              

試劑和器材： 
1. OptiPrepTM（600g/L的碘克沙醇）；
2. 勻漿介質(zhì)：0.25mmol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、20mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
3. OptiPrepTM稀釋液：0.25mmol/L蔗糖、6mmol/L乙二胺四乙酸、120mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
4. 碘克沙醇（500g/L）工作液（IWS）：5體積OptiPrepTM +1體積OptiPrepTM稀釋液；
5. 按要求向勻漿介質(zhì)和OptiPrepTM稀釋液中加入蛋白酶抑制劑；
6. 使用勻漿介質(zhì)制備好的輕線粒體組分；
7. Dounce勻漿器（寬松配制，Wheaton B型）；
8. 兩室梯度制備儀或Gradient MasterTM；
9. 5ml規(guī)格注射器（內(nèi)徑大約為0.8mm），帶金屬套管針；
10. 超速離心機(jī)，配有吊桶式轉(zhuǎn)子（離心管容量為17ml）；
11. 梯度收集器，用來(lái)首先收集低密度或高密度的梯度液；

實(shí)驗(yàn)方法：
   原代細(xì)胞培養(yǎng)后，所有操作均在0—4℃下進(jìn)行。
1. 使用勻漿介質(zhì)稀釋碘克沙醇工作液，獲得碘克沙醇濃度為190g/L及270g/L的梯度溶液，將溶液置于冰上；
2. 使用寬松配制的Dounce勻漿器（用研杵研磨2—3次），在3.0ml的勻漿介質(zhì)中重懸輕線粒體沉淀；
3. 使用碘克沙醇工作液將混懸液碘克沙醇濃度調(diào)整到300g/L；
4. 使用兩室梯度制備儀或者Gradient MasterTM從兩種梯度溶液中各取6ml來(lái)制備線性梯度，置于可在吊桶式轉(zhuǎn)子中離心的管中；
5. 使用注射器和金屬套管針在梯度溶液下鋪入3—4ml在第3步制備的混懸液；
6. 在梯度溶液頂層鋪1—2ml勻漿介質(zhì)使得管中液面離頂部大約3mm，在適宜的吊桶式轉(zhuǎn)子中以大約70000g離心1.5—2h；
7. 可以用密度高的介質(zhì)來(lái)向上取代或者在凹液面上吸出來(lái)的方法先收集梯度溶液中1ml低密度部分?；蛘撸ㄟ^(guò)管刺破或小心地用細(xì)的金屬套管針探入管子的底部（與蠕動(dòng)泵連接）來(lái)先收集密度高的組分；