PriCells: 用Nycodenz○R不連續(xù)梯度溶液純化酵母線粒體

試劑和器材： 
1. 酵母原生質(zhì)體制備于山梨醇緩沖液中；
2. NycoprepTM Universal（600g/L Nycodenz）；
3. Nycodenz○R工作溶液：500g/L Nycodenz；
4. 山梨醇緩沖液：0.6mol/L山梨醇、20mmol/L Mes-KOH，pH6.0；
5. 山梨醇緩沖液（2×）：1.2mol/L山梨醇、40mmol/L Mes-KOH，pH6.0；
6. 懸浮緩沖液：0.6mol/L山梨醇、20mmol/L Mes-KOH，pH7.4；
7. 按要求向溶液加入蛋白酶抑制劑；
8. 高速離心機(jī)，配有8×50ml規(guī)格固定角轉(zhuǎn)子；
9. 超速離心機(jī)，配有可容納12—13ml管吊桶式轉(zhuǎn)子；
10. Dounce勻漿器（約40ml緊密配制，Wheaton A型）；
11. Dounce勻漿器（約40ml寬松配制，Wheaton B型）；

實(shí)驗(yàn)方法：
   所有操作須在0—4℃下進(jìn)行。
1. 使用緊致配制Dounce勻漿器用研杵研磨15次來勻漿原生質(zhì)體；
2. 用等體積的山梨醇緩沖液稀釋，并用固定角轉(zhuǎn)子在1500g轉(zhuǎn)速下離心5min；
3. 輕輕倒出上清液，并保留沉淀；
4. 用山梨醇緩沖液將沉淀重懸到原體積，再重復(fù)第1、2步操作；
5. 合并所有上清液，在12000g轉(zhuǎn)速下離心10min；
6. 將粗制的線粒體沉淀在約40ml的山梨醇緩沖液中重懸，用寬松配制的Dounce勻漿器輕輕地研磨幾次；
7. 1500g下離心5min，以去除剩余的核和碎屑；
8. 用帶金屬套管針的注射器將上清去除，當(dāng)心不要攪到疏松堆積的沉淀；
9. 12000g將上清離心10min，在約4ml的山梨醇緩沖液中重懸沉淀（使用寬松配制的Dounce勻漿器）；
10. 從25ml山梨醇緩沖液（2×）和18ml（和14.5ml）500g/L Nycodenz工作溶液來制備兩種180g/L和145g/L的Nycodenz溶液；用水將每種溶液配制到50ml；
11. 在適用于吊桶式轉(zhuǎn)子的管中裝入這些Nycodenz溶液各5ml以及約2ml的粗制線粒體混懸液（若有必要，用山梨醇緩沖液注滿）；
12. 在約200000g下離心30min。純化的線粒體在兩種Nycodenz溶液界面上呈帶；
13. 用帶金屬套管針的注射器收集區(qū)帶；用4倍體積的懸浮緩沖液來稀釋；12000g離心15min，在懸浮緩沖液中重懸沉淀；