PriCells: 原代細(xì)胞中期染色體的分離                                                                 

試劑和器材： 
1. 秋水仙胺；
2. 2-甲-2，4-戊二醇緩沖液：1mol/L 2-甲-2，4-戊二醇、0.5mmol/L CaCl^₂、0.1mmol/L Pipes-NaOH，pH6.8；
3. 梯度溶液：用2-甲-2，4-戊二醇緩沖液配制成280g/L、580g/L和600g/L的Nycodenz○R；
4. 二甲基二氯硅烷（10g/L濃度溶于四氯化碳中）；
5. 低速離心機(jī)與高速離心機(jī)；
6. 高速離心機(jī)，配吊桶式轉(zhuǎn)子；
7. 用于吊桶式轉(zhuǎn)子的15ml Corex管；
8. 23號(hào)注射器，帶金屬套管針；
9. 相差顯微鏡；
10. 雙室梯度儀或者Gradient MasterTM；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 用二甲基二氯硅烷處理Corex管5min，然后60℃烘烤24h；
2. 向培養(yǎng)基中添加6×10-5g/ml的秋水仙胺，使培養(yǎng)原代細(xì)胞停滯在細(xì)胞分裂的中期，并孵育3h；
3. 輕輕振搖以選擇性分離中期細(xì)胞，對(duì)分離的原代細(xì)胞4℃預(yù)冷20min，300g離心5min使之沉淀；
4. 用2-甲-2，4-戊二醇緩沖液重懸原代細(xì)胞并洗滌，之后再沉淀細(xì)胞（同步驟3）；
5. 以相同的緩沖液重懸細(xì)胞（細(xì)胞濃度應(yīng)小于2g/L），37℃孵育10min，用23號(hào)注射針抽吸細(xì)胞懸液數(shù)次以裂解細(xì)胞，通過相差顯微鏡觀察監(jiān)視裂解過程；
6. 2000g離心10min以沉淀染色體；
7. 在處理過的Corex管中用等體積的280g/L和580g/L Nycodenz○R制備10ml梯度溶液，并將用600g/L Nycodenz○R懸浮的染色體沉淀放置于管底；
8. 16300g離心10min，染色體帶（密度約為1.23g/ml）大約處于梯度的2/3位置；
9. 原代細(xì)胞中期染色體可以通過顯帶法染色；