PriCells: MSCs分化為脂肪細(xì)胞

試劑和材料：
1. *培養(yǎng)基（CCM）：α-MEM：α-*基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，無核苷酸或脫氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經(jīng)FBS雜交瘤純化，非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。過濾除菌。儲存于4℃，不超過2周；
2. FDM（脂肪分化培養(yǎng)基）：①FDM：CCM包含0.5μmol/L IBMX，50μmol/mlIM和0.5μmol/L地塞米松。②異丁基甲基huang嘌呤（IBMX），1000×儲存液，用甲醇配制成0.5mmol/L。③吲哚美辛（IM）：1000×儲存液，用甲醇配制成50mmol/L。④地塞米松：1000×儲存液，用水配制成0.5mmol/L；
3. PBSA；
4. 胰蛋白酶/EDTA；
5. 聚丙烯離心管，15ml和50ml；
6. 組織培養(yǎng)皿，6孔，孔面積為9.6cm²；
7. 0.85%臺盼藍(lán)鹽溶液；
8. 中性福爾馬林緩沖液，10%；
9. ORO工作液：ORO用異丙醇配制成1%，3份。PBSA，2份。70μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾；
10. 改良的Neubauer血細(xì)胞計數(shù)器；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 從單層細(xì)胞中收集MSCs；
2. 向6孔培養(yǎng)板的每個孔中加入2ml CCM，共有1×10⁵個細(xì)胞（適用于人或大鼠）。最終密度約1×10³個細(xì)胞/cm²；
3. 將上排3個孔標(biāo)記為“成脂"，下排3個孔標(biāo)記為“陰性"；
4. 在37℃，5%CO_²環(huán)境下孵育，每隔兩天更換一次培養(yǎng)基，直到細(xì)胞達(dá)到7.%—80%匯合；
5. 達(dá)到所需的細(xì)胞密度時，從孔中吸出*樣機(jī)，向6孔培養(yǎng)板上排的孔中加入2ml FDM，向下排

的孔中加入2ml CCM；
6. 在37℃，5%CO_²環(huán)境下孵育，每隔兩天更換一次培養(yǎng)基。ORO檢測時，于21天對細(xì)胞進(jìn)行染色；
（1） 從培養(yǎng)箱中取出分化后的MSCs，每孔中的單層細(xì)胞用2ml PBSA潤洗兩次；
（2） 每孔中加入2ml福爾馬林，室溫固定單層細(xì)胞10min；
（3） 吸出福爾馬林，每孔中加入2ml PBSA潤洗兩次后，再用2ml蒸餾水潤洗一次；
（4） 加入2ml ORO工作液，室溫孵育30min；
（5） 過量PBSA潤洗各孔，直到“陰性"孔中的背景染色最大限度地清除；
7. 用顯微鏡觀察標(biāo)記為“成脂"的單層細(xì)胞評價脂滴的染色程度。成脂分化達(dá)到令人滿意的水平

時，單層細(xì)胞ORO著色面積超過30%。此時，單層細(xì)胞可在4℃ PBSA中最多存放7天?；蛘?，將ORO從著色

的單層細(xì)胞中提取出來，用先前描述的方案進(jìn)行測定；