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PriCells: 磁珠法分離小鼠T細胞和B細胞
PriCells: 磁珠法分離小鼠T細胞和B細胞
基本方案
用AUTOMACS系統(tǒng)進行總T細胞、CD4+細胞或CD8+T細胞的自動分離
實驗材料
1、小鼠
2、HBSS洗滌緩沖液
3、MACS緩沖液
4、磁珠
5、RPMI-10*培養(yǎng)基
6、AUTOMACS系統(tǒng)和分選柱
7、30μm尼龍網(wǎng)或40μm預分離濾膜
實驗方法
1、用5只小鼠的淋巴結或2只小鼠的脾臟制備單細胞懸液并去除紅細胞。
2、細胞在10mlHBSS洗滌緩沖液中混懸后用血細胞計數(shù)器計數(shù)。
3、細胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清后將沉淀按每108個細胞0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每108個細胞加入0.1ml適當?shù)拇胖楹笤?℃孵育15min。
4、在孵育的時間里，打開AUTOMACS系統(tǒng)電源。按產(chǎn)品說明書中操作規(guī)程運行清潔程序。
5、細胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清，在沉淀中加入足量的MACS緩沖液使細胞濃度達到108個細胞/ml，充分混懸。將細胞通過30μm尼龍網(wǎng)或40μm預分離濾膜。用0.1～0.4mlMACS緩沖液沖洗濾網(wǎng)。
6、細胞放到AUTOMACS的上樣通道。選擇possel程序，這樣標記的細胞將從陽性通道洗脫。
7、細胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清后將沉淀用2～5ml RPMI-10*培養(yǎng)基混懸。計數(shù)。
附錄：
RPMI*培養(yǎng)基：
RPMI1640培養(yǎng)基含有:
2%、5%、10%、15%或20%FBS,56℃熱滅活1h
2μmmol/L L-谷氨酰胺
50μmol/ml 2-ME
100U/ml 青霉素
100μg/ml 硫酸鏈霉素
RPMI-10*培養(yǎng)基：
配制RPMI*培養(yǎng)基加入:
10%（V/V）FBS
1mmol/L 丙酮酸鈉
50μg/ml慶大霉素
10mmol/L HEPES
4℃可保存2周
過濾除菌
HBSS洗滌緩沖液：
HBSS，含有：
5%（V/V）FBS
20mmol/L HEPES，pH7.0
100U/ml 青霉素
100μg/ml 鏈霉素
4℃可保存1個月
MACS緩沖液：
PBS，pH7.2
0.5%（m/V）BSA
2mmol/L EDTA
過濾除菌
用于自動MACS系統(tǒng)，室溫儲存1個月
用于LS或LD柱時，脫氣，4℃保存