PriCells -  正常人臍靜脈原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

一、實驗試劑

1、培養(yǎng)基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement

2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO

3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S

4、染色液： 0.4% Trypan Blue 

5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit

6、檢測試劑：抗人Ⅷ因子抗體，熒光標(biāo)記二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）

二、實驗器械

1、培養(yǎng)皿

2、培養(yǎng)瓶

3、直剪和眼科剪

4、眼科鑷和止血鉗

5、10ml注射器

6、玻璃滴管

7、燒杯

8、15ml離心管

三、實驗流程

取材

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洗滌臍帶外xue漬,將膠帶剪為15cm左右長

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PBS灌洗，去掉淤血

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推注空氣，排出殘存1 × PBS （pH 7.4 ）

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注射器灌注消化液（PriCells），至另一端有消化液流出時用止血鉗截斷，繼續(xù)灌注消化液至血管充盈用另一止血鉗截斷此端，放置到含抗生素1 × PBS （pH 7.4 ）燒杯中

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燒杯放置到37℃，15-20min水浴 恒溫消化，間隔2-3min搖動

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收集消化液，用培養(yǎng)基洗滌靜脈3-4次，3ml/次，之后加入消化終止液（PriCells）反應(yīng)

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離心，1000rmp,10min，棄去上清

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重懸，計數(shù)細(xì)胞

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接種密度以5 × 105個/ml

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培養(yǎng)37℃，5%CO2

四、實驗操作

1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。

2、取材：正常分娩胎兒臍帶，長15-20cm。

3、材料預(yù)處理：將獲取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反復(fù)洗滌，去除臍帶外部的xue漬，之后用注射器吸取洗滌液反復(fù)灌住沖洗臍帶靜脈血管，至血管內(nèi)無xue漬，洗滌液澄清為止。

4、消化液：用注射器關(guān)注空氣推注入血管中，排出殘余洗滌液，在從血管一端開口處注入消化液，當(dāng)另一開口端有消化液流出即可用止血鉗結(jié)扎血管，繼續(xù)灌注消化液，到血管充盈為止，同樣用止血鉗截流血管，放入含無菌PBS的燒杯中37℃水浴消化30min。

5、終止消化：去掉止血鉗，讓酶液流入預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，按1：1加入消化終止液，中止酶反應(yīng)，用培養(yǎng)基灌注血管清洗3次。

6、收集重懸細(xì)胞：收集中止后的消化液于離心管中，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸，染色計數(shù)細(xì)胞。

7、培養(yǎng)細(xì)胞密度：調(diào)整細(xì)胞密度以5 × 105個/ml 接種入培養(yǎng)瓶。

8、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。

五、細(xì)胞鑒定

1、顯微鑒定：相差顯微鏡下，可見細(xì)胞呈梭狀，細(xì)胞密度增高后呈現(xiàn)鵝卵石樣鑲嵌排列，有接觸抑制的特點。細(xì)胞具備良好的透光性。

2、免疫組織化學(xué)鑒定 ：利用Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測（或利用CD31和CD33免疫熒光染色鑒別內(nèi)皮細(xì)胞）。

3、細(xì)胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞為3×104個/孔，48小時候細(xì)胞可以長滿，用鑷子取出

鋪滿細(xì)胞的蓋玻片備用。

4、細(xì)胞固定：用PBS洗滌細(xì)胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空氣中自然干燥。

5、特異性抗體：按照說明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37℃孵育60min。

6、洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。

7、標(biāo)記性抗體：加入熒光標(biāo)記抗體，37℃孵育30min。

洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。

8、封片：封片劑封片。

9、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察，內(nèi)皮細(xì)胞包質(zhì)呈現(xiàn)較強(qiáng)黃綠色熒光，細(xì)胞核周圍尤其明顯。 

六、注意事項

1、選材注意選取圓潤飽滿無扭曲變形的臍帶，臍帶血管中無xue塊凝固阻塞，臍帶長度大于15cm。取材過程盡可能保證無菌，若距離實驗室比較遠(yuǎn)，可以將獲取的臍帶先用含有抗生素的PBS洗滌去除殘血，之后浸泡到此洗滌液中，低溫冰盒帶回實驗室。

2、注意盡可能消除血管內(nèi)的殘血，避免血細(xì)胞及某些血清成分對內(nèi)皮細(xì)胞貼壁的影響。

3、內(nèi)皮細(xì)胞分離損傷嚴(yán)重影響內(nèi)皮細(xì)胞的生長，因此應(yīng)嚴(yán)格掌握好酶的消化濃度和消化時間。

4、嚴(yán)格控制內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)條件。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基，生長因子，血清，抗生素）的質(zhì)量，濃度。

5、關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否，有文獻(xiàn)研究顯示包被與未包被之間沒有特別大的差異。 實驗中，可以酌情考慮是否包被。

6、傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種量為5×104個（25 cm2培養(yǎng)瓶），細(xì)胞倍增時間為48小時。細(xì)胞傳代培養(yǎng)最佳為5-8代， 傳代次數(shù)增加，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞之間間隙增加，細(xì)胞貼壁牢固，傳代消化時間會有所延長。