許多用于生物素化和交聯(lián)的蛋白質(zhì)修飾試劑涉及通過(guò)伯胺。伯胺存在于所有蛋白質(zhì)和肽中，因?yàn)樗鼈儤?gòu)成N末端，也是賴氨酸殘基側(cè)鏈。胺，賴氨酸ε-胺和N-末端α-胺，是蛋白質(zhì)分子中豐富的基團(tuán)并且代表了生物素化最常見(jiàn)的靶標(biāo)。例如，BSA含有59種伯胺，其中多達(dá)35種是可在分子表面獲得，并可與胺反應(yīng)性酯反應(yīng).
廣泛使用的胺反應(yīng)性生物素化和交聯(lián)試劑是水不溶性N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯或水溶性N-羥基磺基琥珀酰亞胺（磺基-NHS）酯。
在磺基NHS酯的N-羥基琥珀酰亞胺環(huán)上添加帶電荷的磺酸鹽（SO3-）導(dǎo)致它們?cè)谒?/span>~10mM），但對(duì)質(zhì)膜不滲透。質(zhì)膜的溶解性和不滲透性使得它們是研究細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的理想選擇，因?yàn)樗鼈冎粫?huì)與血漿外表面的蛋白質(zhì)分子反應(yīng)膜。
兩種形式的NHS酯在水溶液中快速水解（在pH7下7小時(shí)，在pH9下分鐘）
NHS酯類必須妥善處理和儲(chǔ)存。NHS酯應(yīng)干燥儲(chǔ)存，并允許加熱至打開(kāi)前的環(huán)境溫度，以避免冷凝。話雖如此，反復(fù)打開(kāi)和關(guān)閉是不恰當(dāng)?shù)奶幚韺?dǎo)致濕氣的引入和NHS酯的水解。水解（和結(jié)合）導(dǎo)致NHS的釋放，可以通過(guò)以下程序進(jìn)行分析。
方法
所需材料
•NHS酯試劑
•DMSO（類別#BKC-17）或DMF（類別#BK C-16）用于溶解NHS酯
•pH7-8的無(wú)胺緩沖液。我們建議使用磷酸鹽緩沖液，但應(yīng)避免使用Tris和甘氨酸緩沖液
•0.5-1.0氫氧化鈉
•石英試管
•分光光度計(jì)設(shè)置在260-280nm
程序
1.將1-2mg NHS酯試劑溶于2ml無(wú)胺緩沖液中。準(zhǔn)備一個(gè)含有2ml無(wú)胺緩沖液的對(duì)照管。
注：如果使用非水溶性試劑；先溶于0.25ml DMSO或DMF中，然后加入2ml無(wú)胺緩沖液。以類似方式制備對(duì)照管（0.25ml DMSO或DMF和2ml無(wú)胺緩沖液）
2.立即使用對(duì)照管將設(shè)置在260nm的分光光度計(jì)歸零，然后測(cè)量NHSester管的吸光度。
注：如果吸光度>1.0，用無(wú)胺緩沖液稀釋整個(gè)溶液，直到讀數(shù)<1.0。
3.將100µl 0.5-1.0N NaOH添加到1ml來(lái)自步驟2的NHS酯中。渦旋30秒
4.立即（1分鐘內(nèi)）測(cè)量堿性水解試劑的吸光度。
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