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技術文章

高效液相色譜測定金印草生物堿凈化并

閱讀:646          發(fā)布時間:2023-2-13

 在固相萃取技術中應用 Agilent SampliQ 優(yōu)化聚合物技術(OPT)吸附劑,可以進行市售金印草生物堿(黃連堿和小檗堿)樣品的凈化。這些生物堿的分離是以 0.1%磷酸/甲醇溶液為流動相,在 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱(4.6 mm × 75 mm × 3.5 µm)上,采用配備二極管陣列檢測器(DAD)的 Agilent 1200 系列高效液相色譜儀進行。梯度洗脫時的總分析時間僅為 6 分鐘。黃連堿的回收率范圍在 101%到 106%(n=8)指尖,而小檗堿的回收率范圍則在 71%到 82%(n=8)之間,且 RSD%均小于 1。黃連堿的檢測限和定量限分別為 0.50 和 1.65 µg/mL,而小檗堿的檢測限和定量限則分別為 0.47 和1.55 µg/mL。來自 Willow 的金印草樣品含有 17 µg/mL 黃連堿和 35 µg/mL 小檗堿,而來自 Solga 金印草樣品含有 6 µg/mL 黃連堿和 12 µg/mL 小檗堿。


前言金印草(北美黃連)是多年生毛茛科草本植物,原產于加拿大東南部和美國東北部,是一種最古老的草藥植物,也是傳統(tǒng)中藥中常用的藥用植物。金印草的生物活性與異喹啉生物堿黃連堿和小檗堿(結構見圖 1)有關,金印草中還含有其它生物堿,包括白毛莨分堿、四氫小檗堿和氫化小蘗堿[2]。金印草已經用于感染、炎癥的治療和免疫系統(tǒng)增強劑[3]。然而,由于規(guī)范草藥和保健品行業(yè)的新規(guī)章和新法律的緊迫性,建立包括樣品制備、凈化和預濃縮的樣品處理方法在內的普遍適用和高靈敏度分析方法的需求正在增加。樣品前處理是分析過程中最基本的步驟,因為它有利于達到由監(jiān)管部門所設定的低檢測限要求[4]。固相萃取技術(SPE)是目前常用的凈化技術之一,常用于高效液相色譜(HPLC)或氣相色譜(GC)進行環(huán)境、食品、制藥和生物樣品分析之前的樣品處理。與傳統(tǒng)的液-液萃取相比,固相萃取具有很多優(yōu)勢,如有機溶劑使用量小、易于自動化、更低的成本及有毒物殘留量等。近年來,有關新型固相萃取材料的發(fā)展已有諸多報道,如混合模式吸附劑和限制進入型吸附劑、免疫親和萃取吸附劑、分子印跡聚合物、導電聚合物[6,7,8]。本應用報告報道了一種采用 Agilent SampliQ 優(yōu)化聚合物技術(OPT)固相萃取柱,進行金印草中黃連堿和小檗堿固相萃取的優(yōu)化方法,該方法采用了聚合物基吸附劑,大大減少了基體干擾,改善了分析結果。

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實驗部分試劑和化學藥品鹽酸小檗堿和鹽酸黃連堿標準物購自 Sigma- Aldrich 公司(美國)。磷酸和氫氧化鉀購自默克化學公司(南非),而色譜級甲醇則是從默克 KGaA 公司(德國)購買。磷酸二氫鉀購自 Saarchem 分析公司(南非)。金印草膠囊(南非伊麗莎白港 Willow 出品的金印膠囊和美國新澤西州里奧妮亞城索爾加公司出品的索爾加全能香草)購自南非格拉姆斯頓當?shù)氐乃幍辍9滔噍腿≈鶠?AgilentSampliQ OPT 1 mL/30mg。儀器為 1200 系列梯度 HPLC-DAD系統(tǒng),分析柱為 AgilentZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱(4.6 mm × 75 mm × 3.5 µm)。貯備液和標準工作液的配制1000 µg/mL 的黃連堿和小檗堿的甲醇貯備溶液,-4oC 儲存。所有其它標準溶液均按要求用貯備液稀釋配制。


樣品制備首先,對金印草膠囊樣品進行均勻化處理。然后,將 200mg 均勻化處理后的樣品與 50mL 的甲醇混合,用磁力攪拌器攪拌 1 小時,得到有不溶顆粒的懸浮液。然后用疏水的聚二氟乙烯(PVDF)0.45 µm–HV 濾膜(Billerica, MA,美國)過濾。甲醇萃取物按 1:3的比例用水稀釋,用 0.01mol/L 的氫氧化鉀溶液調 pH 值到 7。分離采用 5 µL 黃連堿—小檗堿標準物混合液(濃度均為 50 µg/mL)進行 HPLC 分離條件優(yōu)化。檢測波長為 242 nm,分別采用 294 nm 和350 nm 的波長進行小檗堿和黃連堿的定量。HPLC 條件列于表1 中:

結論Agilent SampliQOPT 固相萃取小柱在傳統(tǒng)中藥—金印草中黃連堿和小檗堿的分離與分析應用中表現(xiàn)出良好的樣品凈化效果。結果表明,該方法重現(xiàn)性好、可靠性高、回收率高(黃連堿的回收率為 101%到 106%,小檗堿的回收率為 71%到 86%),RSD %小于1%。黃連堿的檢測限和定量限分別為 0.50 和 1.65 µg/mL,而小檗堿的檢測限和定量限分別為 0.47 和 1.55 µg/mL。來自 Willow 的金印草樣品含有 17 µg/mL 黃連堿和 35 µg/mL 小檗堿,而來自Solga 的金印草樣品含有 6 µg/mL 黃連堿和 12 µg/mL 小檗堿。

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