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三重四極桿質(zhì)測(cè)定人空白血清中的內(nèi)源性類固醇

閱讀:617          發(fā)布時(shí)間:2022-9-28

 在本研究中,對(duì)人空白血清中的 13 種主要的類固醇進(jìn)行了定量分析(見(jiàn)圖 1 和表 1)。一些類固醇在負(fù)離子模式下有較好的響應(yīng) – 如硫酸脫氫表雄酮 (DHEAS) 會(huì)在溶液中形成陰離子。并且,具有酚結(jié)構(gòu)的類固醇,如雌二醇、雌三醇和雌素酮在正離子模式下失去一個(gè)水分子,并在負(fù)離子模式下形成更碎片離子。其余的類固醇在正離子模式下有更高的檢測(cè)靈敏度。本文展示了一個(gè)在單次運(yùn)行中通過(guò)正/負(fù)離子模式切換定量分析人血清中主要內(nèi)源性類固醇的強(qiáng)大、高靈敏度、可靠和快速的 LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀 方法。該定量方法在人血清分析中展現(xiàn)出了寬動(dòng)態(tài)范圍、優(yōu)良的線性、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。

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實(shí)驗(yàn)部分樣品制備:樣品信息:十三種類固醇標(biāo)準(zhǔn)品和四種同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物(購(gòu)自Cerilliant 公司)列于表 1。血清樣品制備:將 250 µL 人空白血清(購(gòu)自 UTAK Laboratories 公司)與 500 µL 乙腈混合,渦旋 1 min 后以 10000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心 4 min。移取 500 µL 上清液并用 500 µL 水稀釋。在隨后的稀釋中,將該最終提取液用作血清基質(zhì)。純?nèi)軇┖脱寤|(zhì)中的校準(zhǔn)曲線:DHEA、雌酮、雌二醇和雌三醇的校準(zhǔn)范圍為 0.05 - 500 ng/mL。其它 9 種類固醇的校準(zhǔn)范圍為 0.0025 -50 ng/mL。血清基質(zhì)曲線僅用于空白血清中未達(dá)到檢測(cè)濃度的分析物(表 2)。


LC 方法:Agilent 1290 Infinity UHPLC 系列二元泵、多孔板自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱色譜柱:Extend C18,2.1x50mm 1.8 um,600 bar柱溫:50 oC進(jìn)樣體積:2 µL自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4 oC進(jìn)樣針沖洗:沖洗端口(甲醇 : 水 75:25),10 s流動(dòng)相:A = 0.02% 氫氧化銨水溶液B = 甲醇 : 異丙醇 75:25流速:0.4 mL/min梯度程序:7 min 內(nèi)從 20% B 到 47% B,再于 1 min 內(nèi)升至 95% B,保持 0.5 min,后運(yùn)行時(shí)間 1.5 min。每次運(yùn)行的總時(shí)間為 10 min。MS 方法:配備離子漏斗技術(shù)的 Agilent 6490 三重四極桿質(zhì)譜離子模式: 安捷倫噴射流正離子/負(fù)離子干燥氣溫度: 200 oC干燥氣(氮?dú)猓┝髁浚?15 L/min霧化氣壓力(氮?dú)猓?35 psi鞘氣(氮?dú)猓囟龋?250 oC鞘氣流量: 11 L/min毛細(xì)管電壓: +4000V/-3000V噴嘴電壓: +0V/-2000VQ1/Q2 分辨率: 1.2/0.7 單位切換駐留時(shí)間: 40 msDelta EMV: +100V/-100V

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結(jié)論• 8.5 min 內(nèi),13 種類固醇中除了雌二醇均實(shí)現(xiàn)了基線分離。當(dāng)然,雌二醇并非 Androsteronedione 或雌酮的同重化合物,所以不影響其定量計(jì)算• 校準(zhǔn)曲線具有良好的線性 (> 0.995),動(dòng)態(tài)范圍超過(guò)三個(gè)數(shù)量級(jí)• 13 種類固醇的 LC-MS/MS (QQQ) 分析實(shí)現(xiàn)了良好的準(zhǔn)確度、精密度、重現(xiàn)性和信號(hào)穩(wěn)定性• 該快速簡(jiǎn)便的 LC-MS/MS 方法適用于在單次運(yùn)行中分析生物基質(zhì)內(nèi)的一些內(nèi)源性類固醇

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