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案例分享 | 帶你了解多肽的分離
01 多肽的性質(zhì)
多肽由多個(gè)氨基酸依次連接而成的化合物，氨基酸是兩性化合物，具有兩性離子的特性。
02 影響多肽分離的因素
1
色譜柱填料孔徑（120?、300?）
2
添加劑及濃度（甲酸、離子對(duì)試劑）
3
pH
4
洗脫溶劑（乙腈、甲醇、異丙醇）
5
梯度
6
溫度
7
流速
孔徑是指硅膠球上小孔的直徑。分子進(jìn)入小孔，在小孔內(nèi)被鍵合的烷基吸附，達(dá)到分離的效果?？讖叫?，含孔率高，比表面積大，載碳量高。分子在孔內(nèi)分離，孔徑大小必須和分子大小相匹配，分子必須能進(jìn)入孔內(nèi)，一般小分子使用80-120?，大分子通常使用300?，為了達(dá)到最佳分離，一般要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上。
低pH減少了酸性側(cè)鏈的解離，離子對(duì)試劑（比如三氟yi酸）與肽鏈堿性側(cè)鏈作用，中和其電性，電荷的減少使多肽的疏水作用增強(qiáng)，堿性多肽側(cè)鏈與硅醇基無(wú)法產(chǎn)生吸附，但離子對(duì)試劑會(huì)使得MS的離子化效率降低。Mid-Autumn Festival
03 項(xiàng)目案例
液相上的分離：
色譜柱：月旭UItimate® XB-C18（2.1×100mm，5μm 300?）。
流動(dòng)相：梯度 A（0.1%三氟yi酸） B（0.1%甲酸乙腈）；
柱溫：40℃；
紫外檢測(cè)器：220nm；
流速：0.3mL/min；
進(jìn)樣量：5μL。
討論：
多肽化合物分子量大約為2000，選擇120?孔徑和300?孔徑均可以達(dá)到有效保留，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)120?的峰形差，分析可能是該物質(zhì)在這個(gè)體系中的分子體積較大，故在300?的柱子上峰形有了明顯的改善。可見(jiàn)分子量可以用于選擇填料孔徑的參考，但不是絕對(duì)的，做多肽時(shí)建議常規(guī)孔徑120?和大孔徑300?的色譜柱都做一下嘗試，選擇更合適的孔徑；
流動(dòng)相中使用甲酸為添加劑時(shí)沒(méi)有保留，選擇具有離子對(duì)作用的三氟yi酸時(shí)保留良好，該體系是檢測(cè)多肽時(shí)的常規(guī)shou選體系，再根據(jù)該體系下的結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。