紫外吸收法測(cè)定核酸的含量

目的要求

        學(xué)習(xí)紫外線（UV）吸收法測(cè)定核酸濃度的原理。

實(shí)驗(yàn)原理

    核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性質(zhì)，其吸收高峰在260nm波長(zhǎng)處。核酸的摩爾消光系數(shù)（或稱吸收系數(shù)）用（p）來表示。（p）為每升溶液中含有1g原子核酸麟的光吸收值（即A值）。測(cè)得未知濃度核酸溶液的A260nm值，即可以計(jì)算出其中RNA或DNA的含量。該法操作簡(jiǎn)便，迅速，并對(duì)被測(cè)樣品無(wú)損，用量也少。

    蛋白質(zhì)也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm波長(zhǎng)處，在260nm出的吸收值僅為核酸的1/10或更低，因此對(duì)于含有微量蛋白質(zhì)的核酸樣品，測(cè)定誤差較小。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上。DNA的260nm與280nm吸收的比值則在1.9左右，當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，比值下降。若樣品內(nèi)混有大量的蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光的物質(zhì)，應(yīng)設(shè)法先出去。

試劑和器材

1、試劑

    鉬酸銨-過氯酸沉淀劑：取3.6mL，70%過氯酸和0.25g鉬酸銨溶于96.4mL蒸餾水中，即成0.25%鉬酸銨-2.5%過氯酸溶液。

   5%～6%氨水：用25%～30%氨水稀釋5倍。

2、測(cè)試樣品

    RNA或DNA干粉

3、器材

    移液管0.5mL（×2），2mL（×3）；容量瓶50mL（×3）；離心機(jī)；水浴；分光光度計(jì)。

操作方法

（1）、準(zhǔn)確稱取待測(cè)核酸樣品0.5g，加少量0.01mol/L  NaOH調(diào)成糊狀，再加適量水，用5%～6%氨水調(diào)至pH7.0，定容至50mL。

（2）、取兩支離心管，甲管加入2mL樣品溶液和2mL蒸餾水，乙管加入2mL樣品溶液和2mL沉淀劑?；靹?，在水浴上放置30min。

（3）、在3000r/min下離心10min。從甲、乙兩管中分別吸取0.5mL上清液，用蒸餾水定容至50mL。選擇厚度為1cm的石英比色杯，在260nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。