影響酶促反應(yīng)的因素—溫度、PH和抑制劑

目的要求

 通過本實(shí)驗(yàn)了解pH、溫度、抑制劑對酶活力的影響。

實(shí)驗(yàn)原理

 酶作為生物催化劑與一般催化劑一樣呈現(xiàn)溫度效應(yīng)。酶促反應(yīng)開始時(shí)，反應(yīng)速度隨溫度升高增快。達(dá)到zui大反應(yīng)速度時(shí)的溫度稱為某種酶的zui適溫度。由于絕大多數(shù)酶是有活性的蛋白質(zhì)，當(dāng)達(dá)到zui適溫度后，繼續(xù)升高溫度，引起蛋白質(zhì)變性，酶促反應(yīng)速度反而逐步下降，以致*停止。

    酶的zui適溫度不是一個(gè)常熟，與作用時(shí)間長短有關(guān)。測定酶活性均在酶促反應(yīng)zui適溫度下進(jìn)行。大多數(shù)動(dòng)物來源的酶zui適溫度為37～40℃，植物來源的酶zui適溫度為50～60℃。

    酶的催化活性與環(huán)境pH有密切關(guān)系，通常各種酶只在一定pH范圍內(nèi)才具有活性，酶活性zui高時(shí)的pH，稱為酶的zui適pH。高于或低于此pH時(shí)酶的活性逐漸降低。

   酶的zui適pH不是一個(gè)特征物理常數(shù)，對于同一個(gè)酶，其zui適pH因緩沖液和底物的性質(zhì)不同而又差異。

   在酶促反應(yīng)過程中，抑制劑對酶的抑制作用可分為可逆抑制和不可逆抑制?？赡嬉种朴懈鶕?jù)抑制劑和底物的關(guān)系分為三種類型：競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。

   在本試驗(yàn)中，胰蛋白酶的zui適溫度為37℃，zui適pH值為8.1.胰蛋白酶的抑制劑為苯甲脒，其抑制方式為競爭性抑制。

試劑和器材

1、試劑

5%三氯醋酸溶液。1mmol/L苯甲脒溶液：稱取19.25g苯甲脒，用少量水溶解，定容至100mL。

1%酪蛋白溶液：取1g酪蛋白，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液10mL、水40mL，置60℃水浴加熱至溶解，放置室溫后，加水稀釋成100mL，并調(diào)至pH8.0.

0.1mol/L硼酸緩沖液：

A液，0.1mol/L硼酸（H3BO3）：稱取6.18gH3BO3溶于1000mL水中。

B液，0.025mol/L硼砂（Na2B4O7·10H2O）：

稱取9.54g硼砂（Na2B4O7·10H2O）溶于1000mL水中。

pH7.4硼酸緩沖液：90mL A液+10mL B液

pH8.0硼酸緩沖液：70mL A液+30mL B液

pH9.0硼酸緩沖液：20mL A液+80mL B液

2、材料

胰蛋白酶溶液：50～200ug/mL，用0.1mol/L，pH8.0硼酸緩沖液配制。可用粗提的豬胰蛋白酶，用量根據(jù)實(shí)際測的比活值而定。

3、儀器

試管1.5cm×15cm（×19）；移液管1mL（×7），2mL（×3），5mL（×5）；量筒100mL（×1），恒溫水浴；水浴90(0℃）；白瓷板；膠頭滴管。

操作方法

1、溫度對酶活力的影響

取3支試管，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，搖勻后，再加入0.2mL酶液，0.8mL蒸餾水，在37℃保溫10min。

將樣品管和空白管分別離心，3000r/min，5分鐘，取上清液于280nm處測定各管的吸光值，并比較之。

2、pH對酶活力的影響

取3支試管，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，搖勻后，再加入0.2mL酶液，0.8蒸餾水，在37℃保溫10min。

 將樣品管和空白管分別離心，3000r/min，5分鐘，取上清液于280nm處測定各管的吸光值，并比較之。

3、抑制劑對酶活力的影響

取3支試管，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，搖勻后，再加入0.2mL酶液，0.8蒸餾水，在37℃保溫10min。

將樣品管和空白管分別離心，3000r/min，5分鐘，取上清液于280nm處測定各管的吸光值。并比較之。

注意事項(xiàng)

1、由于胰蛋白酶活力不同，因此實(shí)驗(yàn)應(yīng)隨時(shí)檢查反應(yīng)進(jìn)行情況。如反應(yīng)進(jìn)行的太快，應(yīng)適當(dāng)稀釋酶液；反之，則應(yīng)減少酶溶液的稀釋倍數(shù)。

2、注意不要在檢查反應(yīng)程度時(shí)使各管溶液混雜。