主要用途

    細(xì)菌氧化應(yīng)激活性氧高質(zhì)熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過(guò)透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯，在細(xì)菌氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來(lái)定量檢測(cè)細(xì)菌活性氧族的生成和增加的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種實(shí)驗(yàn)用細(xì)菌菌株氧化應(yīng)激活性氧的分析。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定，滯留持久，熒光清晰。

技術(shù)背景

     細(xì)菌作為模式生物，是環(huán)境化學(xué)毒性研究的常用工具。活性氧的檢測(cè)可以用于諸如多環(huán)芳烴化合物或重金屬的毒性作用以及修復(fù)（remediation）的評(píng)價(jià)指標(biāo)。超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級(jí)產(chǎn)品，一種*自由通過(guò)細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過(guò)氧化氫、羥自由基或氫氧基、過(guò)氧化基、次氯酸等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測(cè)定細(xì)菌活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）    毫升

染色液（Reagent B）    微升

稀釋液（Reagent C）    毫升

溶解液（Reagent D）    毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)    1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于染色的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育

200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光定量分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、直接測(cè)定

1. 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的待測(cè)菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細(xì)胞/毫升）
2. 移取200微升到1.5毫升離心管
3. 加入xx微升染色液（Reagent B），混勻
4. 轉(zhuǎn)移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
5. 放進(jìn)37℃熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm）：每隔5分鐘測(cè)讀一次，持續(xù)120分鐘――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
6. 構(gòu)建活性氧和時(shí)間關(guān)系曲線

• ?二、培養(yǎng)上清測(cè)定

1. 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的待測(cè)菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細(xì)胞/毫升）
2. 移入到1.5毫升離心管
3. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
4. 小心移取200微升上清液到1.5毫升離心管
5. 加入xx微升染色液（Reagent B），混勻
6. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里或恒溫水槽孵育30至60分鐘，避免光照
7. 轉(zhuǎn)移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
8. 放進(jìn)37℃熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高

三、細(xì)菌內(nèi)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入冰槽里。然后進(jìn)行下列操作。

1. 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的待測(cè)菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細(xì)胞/毫升）
2. 移入到1.5毫升離心管
3. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
4. 小心抽掉上清液
5. 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
6. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
7. 小心抽掉上清液
8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟5至7一次
9. 加入xx微升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，混勻
10. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里或恒溫水槽孵育30分鐘，避免光照
11. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
12. 小心抽掉上清液
13. 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
14. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
15. 小心抽掉上清液
16. 加入xx微升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
17. 加入xx微升溶解液（Reagent D）
18. 上下傾倒混勻數(shù)次
19. 轉(zhuǎn)移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
20. 放進(jìn)37℃熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
21. 或每隔5分鐘測(cè)讀一次，持續(xù)30分鐘――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
22. 構(gòu)建活性氧和時(shí)間關(guān)系曲線

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品為50次操作
2. 操作時(shí)，須戴手套
3. 操作時(shí)，避免污染母液
4. 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
5. 孵育時(shí)，必須避免光照
6. 本產(chǎn)品染色劑不易洗掉，染色持久
7. 本公司提供陽(yáng)性對(duì)照甲萘醌溶液（GMS12041），觀察細(xì)胞熒光增強(qiáng)現(xiàn)象
8. 本公司同時(shí)提供細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)活性氧初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒（GMS10016.14），滿(mǎn)足不同用戶(hù)需求
9. 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品