α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

測(cè)定意義

α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動(dòng)物、植物微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是三羧酸循環(huán)調(diào)控關(guān)鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶 A。

測(cè)定原理

α-KGDH 催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和輔酶 A 生成琥珀酰輔酶 A、二氧化碳和 NADH，NADH在 340 nm 有特征吸收峰，以 NADH 的生成速率表示α-KGDH 活性。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：50mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：10mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：1mL×1 支，-20℃保存；試劑四：液體 55.5mL×1 瓶，4℃保存；試劑五：粉劑×1 支，4℃保存；試劑六：粉劑×1 支，4℃保存；試劑七：粉劑×1 支，4℃保存;試劑八：粉劑×1 支，4℃保存;試劑九：粉劑×1 支，-20℃保存;

試劑十：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 2.1mL 蒸餾水充分混勻待用，用不完的試劑仍-20℃保存。

工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六、試劑七、試劑八和試劑九轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、稱(chēng)取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的α-KGDH（此步可選做）。

5、在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體α-KGDH 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm 處，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。

3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 40μL 試劑十、60μL 樣本和 1.1mL 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 的吸光值 A1 和 2min20s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

α-KGDH 活性計(jì)算

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

α-KGDH 活性（U/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

α-KGDH（U/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=325×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

α-KGDH 活性（U/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.65×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.2×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：

比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.06 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。