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在綜合考慮靈敏度、易用性和成本時，Elispot平臺很可能成為科研、治療和診斷領(lǐng)域開發(fā)多功能T細胞分析的上乘之選，在zui近方興未艾的細胞免疫治療方法開發(fā)中再獲關(guān)注。

在體外T細胞效應(yīng)功能研究中，zui常用的分析包括流式細胞分析、Elispot、ELISA、多重微球芯片（又稱為多因子檢測或液相芯片等）和定量PCR。雖然每種分析都有著特定的優(yōu)點和限制，但Elispot分析具有明顯的優(yōu)勢：ELISpot就像基于流式細胞術(shù)的細胞內(nèi)細胞因子染色（ICS），能直接確定抗原（Ag）特異的T細胞頻率——而這正是免疫診斷的核心競爭力。

這樣的分辨能力是上清分析所無法達到的，如ELISA或多重微球芯片，它們的測定是基于特定樣品孔中所有細胞產(chǎn)生的大量細胞因子。在急性HIV患者中，產(chǎn)生IFNγ以應(yīng)答共同回憶抗原（如TT或PPD）的細胞頻率與健康個體相當，而斑點尺寸大大降低。這一結(jié)果表明，HIV特異的T細胞功能受到損傷，而非細胞數(shù)量減少。

同樣地，與“舊的”記憶T細胞相比，zui近體內(nèi)激活的T細胞可能表現(xiàn)出每個細胞的細胞因子生產(chǎn)量有所增加。區(qū)分長期記憶亞群和zui近激活亞群的能力對自身免疫性疾病和慢性感染的T細胞診斷很有意義。大量分析結(jié)果被先天免疫系統(tǒng)的背景信號所混淆?？乖禺悜?yīng)答的稀釋導致整個信號峰變得扁平，而這個問題在檢測罕見群體的存在時影響zui大，例如PBMC中的循環(huán)腫瘤細胞（CTC）或骨髓中的散布腫瘤細胞，它們都是轉(zhuǎn)移的早期標志物。

已知T細胞能夠識別幾乎無限數(shù)量的可感染物質(zhì)并且同時能將它們與自身區(qū)分開來，總的初始細胞庫包含≥1012種*的T細胞受體（TCR）特異性。因此，在不存在感染時，特異識別一種抗原的循環(huán)記憶細胞的出現(xiàn)頻率是相當?shù)偷模ǔＴ?:10,000 -1,000,000。要檢測如此罕見的細胞，對于靈敏度的下限僅為0.02%的流式平臺來說*無法勝任。

而那些以培養(yǎng)上清檢測細胞因子的方法，如果液相芯片或ELISA，因周圍環(huán)境對分析物的稀釋、周圍細胞的吸收以及酶的降解，其檢測靈敏度會被進一步降低。相比之下，Elispot分析顯示出每100萬個PBMC中不到25個生產(chǎn)IFNγ的T細胞的檢測閾值（0.0025%）；這相當于檢測靈敏度提高了近10倍。Elispot分析的高靈敏度對過敏研究也很重要，其中鑒定極低頻率的Th2產(chǎn)細胞因子細胞對疾病監(jiān)控和免疫療法的開發(fā)都很關(guān)鍵。特別是在流式細胞儀和ELISA平臺上都已證實不足以檢測的IL-4，而這正是Th2驅(qū)動應(yīng)答的主要指標。

Elispot分析的開發(fā)始于1983年，是以平板為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）和以膜為基礎(chǔ)的Western blotting技術(shù)的融合，可實現(xiàn)在單細胞水平檢測分泌的分析對象。與標準的聚苯乙烯表面相比，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜大大改善了抗體結(jié)合特性，更強的結(jié)合膜表面具有更高的Ab密度，帶來更明確的斑點。微孔板形式則進一步提高了操作通量，也容易實現(xiàn)自動化；更多樣品，更多刺激條件，或更多不同的細胞因子可在相鄰孔中同時平行。Elispot是可實現(xiàn)對單細胞進行生物學功能（如細胞因子的釋放）定量分析的少數(shù)幾種技術(shù)之一。

流式細胞儀剛剛啟動時會有不少樣品損失，與之不同，Elispot中的每個細胞都會被測定。Elispot 需要的細胞數(shù)僅為流式分析的十分之一，這對于那些珍貴的（如遠程取樣）和/ 或有限的（如細胞治療病人，小兒或免疫抑制檢測的受試者）的樣品至關(guān)重要。96孔板一直存在一個問題，即小規(guī)模分析中浪費了未使用的孔，比如單個患者樣品的診斷分析。默克生命科學特別提供了8聯(lián)管（目錄號M8ips4510），這種聯(lián)管是透明的，適合FluoroSpot應(yīng)用，以及標準的酶學分析，表現(xiàn)與標準96孔板相當。

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ELISpot技術(shù)極為靈敏，但對操作經(jīng)驗有一定的要求。在此，默克生命科學基于開發(fā)這個技術(shù)所積累的經(jīng)驗，為您用好這個免疫細胞檢測的技術(shù)平臺提供非常有用的Tips，助您獲得而有意義的數(shù)據(jù)。 （生物谷 bioon.com）侵刪