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近幾年，二代建庫測序周期已經(jīng)得到飛速提升，同時第二代短讀長測序技術(shù)在測序市場上仍然占有絕對優(yōu)勢，但第三代測序技術(shù)自2008年以來也發(fā)展的如火如荼，憑借其長讀長優(yōu)勢且測序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨(dú)測序，已廣泛應(yīng)用于基因組拼接、病原體研究和突變鑒定等多種方面。
三代測序之原理篇
第三代測序技術(shù)又稱為單分子DNA測序，即通過現(xiàn)代光學(xué)、高分子、納米技術(shù)等手段來區(qū)分堿基信號差異的原理，以達(dá)到直接讀取序列信息的目的。目前商業(yè)化主流的三代測序技術(shù)是Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)。與前兩代技術(shù)相比，他們最大的特點(diǎn)是單分子測序，其中SMRT技術(shù)利用熒光信號進(jìn)行測序，而納米孔單分子測序技術(shù)利用不同堿基產(chǎn)生的電信號進(jìn)行測序。
三代測序之應(yīng)用篇
目前長讀長測序的三代測序平臺，已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜動植物基因組、微生物基因組、全長轉(zhuǎn)錄組、微生物群體研究及人類基因組變異檢測等領(lǐng)域的科研項(xiàng)目中，以解決這些科研領(lǐng)域檢測技術(shù)瓶頸的問題。在臨床疾病檢測方面，三代測序技術(shù)在基因組結(jié)構(gòu)變異、短串聯(lián)重復(fù)/微衛(wèi)星、甲基化檢測等遺傳病及腫瘤基因檢測相關(guān)領(lǐng)域具有獨(dú)到的優(yōu)勢，目前基于三代測序技術(shù)的遺傳病基因診斷產(chǎn)品層出不窮。
三代文庫制備之DNA/RNA QC
提取后DNA/RNA的質(zhì)量會影響文庫制備，因?yàn)檫x擇不同的提取方法，DNA/RNA樣品中會有不同的化學(xué)試劑殘留可能抑制酶的活性，同時DNA/RNA的完整性影響下游文庫制備效率，進(jìn)而影響測序質(zhì)量。
純度：DNA/RNA純度較高，無RNA或DNA、蛋白質(zhì)污染（需專門適配長片段提取試劑盒）；
濃度：大于等于30 ng/uL；
完整性：無降解，DNA脈沖場凝膠分析測量的平均片段大小>30kb，RNA RIN≥8；
樣品量：DNA大于等于1 μg（不同數(shù)據(jù)量需求略有不同）；
建議使用TE緩沖液長期儲存高分子量（HMW）gDNA。
三代文庫制備之?dāng)?shù)據(jù)質(zhì)控
不同于二代測序的堿基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Q20/Q30，三代測序由于其隨機(jī)分布的堿基錯誤率，其單堿基的準(zhǔn)確性不能直接用于衡量數(shù)據(jù)質(zhì)量。最直接的方法是看長度。長度短的測序數(shù)據(jù)不一定差（與文庫大小有關(guān)），但差的數(shù)據(jù)長度一定短。在上游測序，最關(guān)鍵的影響因素是文庫的構(gòu)建。高質(zhì)量的文庫產(chǎn)出的數(shù)據(jù)長度長，質(zhì)量好；而低質(zhì)量的文庫產(chǎn)出的數(shù)據(jù)長度短，質(zhì)量差。
PacBio 測序數(shù)據(jù)QC：數(shù)據(jù)產(chǎn)出（G）、酶讀長、插入片段長度、subreads N50
nanopore測序數(shù)據(jù)QC：數(shù)據(jù)產(chǎn)出（G）、平均讀長、平均質(zhì)量值（Q）、Read length N50、最長reads長度及質(zhì)量值，最重要的兩個指標(biāo)為長度分布與平均Q值。
翌圣生物匠心研發(fā)多款適配Nanopore平臺的建庫試劑盒滿足眾多客戶的不同需求，助力科學(xué)研究和臨床檢測更精準(zhǔn)、更快捷！
翌圣三代建庫產(chǎn)品選擇指南
產(chǎn)品類別 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
連接法建庫 | Hieff® DNA Library Prep Kit for ONT | 13301ES |
末修加A模塊 | Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT | 13302ES |
Barcode接頭連接模塊 | Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT | 13303ES |
馬達(dá)蛋白接頭連接模塊 | Hieff ® Adapter Ligation Module for ONT | 13304ES |
片段化/末修/加A模塊 | Hieff ® Adapter Ligation Module for ONT | 13309ES |
長片段高保真擴(kuò)增酶 | Hieff NGS® Multiplex Long PCR Master Mix | 17228ES |
配套建庫產(chǎn)品 | Hieff NGS® DNA Selection Beads 分選磁珠(替代AMPure XPBeads) | 12601ES |
1×dsDNA HS Assay Kit | 12642ES |
